光片荧光显微镜(Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM)的概念产生于1903年,但此后很长时间并无太多发展。上世纪九十年代,华盛顿大学的Francis Spelman实验室为了对小鼠毛细胞的结构和耳蜗的其他特性进行定量测量,发展了一系列实验方法。实验室研究人员受到前人使用侧向光片照明观察表面结构的启发,发明了正交平面荧光光学切片装置(orthogonal plane fluorescence optical sectioning, OPFOS),并第一次获得了整个耳蜗的清晰荧光图像(1) (2) (3)。2004年,SPIM(Single plane illumination microscopy )文章的发表大大促进了光片显微镜的发展和使用(4),文章强调了其用于胚胎发育研究的实用性,并给出了青鳉神经节细胞搏动以及果蝇胚胎发育长时间成像的荧光图像。 2010年,在第一届光片荧光显微镜研讨会上,研究者们决定将LSFM作为这一类显微镜的统一名称(5)。后续又出现了很多形式的光片显微镜,如扫描光片(6)、双光子扫描光片(7)和bessel beam(8)、lattice(9)等新式光片显微镜。这些方法不断改善光片显微镜的成像分辨率、穿透深度和成像视野,以期满足生物学发展的需要。
光片显微系统成像原理
光片显微系统使用一层光束从样品侧面激发荧光样品,使用CCD或SCMOS进行检测,照明光路和荧光检测光路互相垂直。由于样品受激发的平面就是成像平面,不存在离焦激发,可以自动获得光学切片,从而将光漂白和光学损伤降到最低。光片显微系统使用CCD或SCMOS成像,速度通常为每秒几十帧,甚至上百帧,所以通过在光片下移动样品使入射光束激发不同的平面,可以很容易又非常快速的得到整个组织的3D图传统共聚焦的激发和检测是同一个方向,整个照射区域都处于被激发状态,没有被检测的区域经过长时间的照射易被淬灭,无法保证几天的记录;另外共聚焦使用点扫描成像,速度相对较慢。